分享过听课笔记，但很少与各位一起分享探讨过实验笔记，为什么同样的实验在不同的人手里，实验结果可能存在些微差异，主要就在于操作细节，近期计划分享ta们（丰富经验）的实验笔记，今天是RNA提取的实验笔记，讲述RNA提取细则，以期为一线实验员提供借鉴参考，也欢迎广大实验员共同探讨与分享。

RNA不太稳定的原因

● 内因：核糖2-羟基可在碱性条件下形成烷氧负离子，并可向3-位磷酸二酯键进行分子内的亲核进攻(向磷-氧双键)，形成五元环的环状磷酸二酯，同时离去部分RNA 片段，造成RNA降解；

● 外因：生物体内部和外部环境中存在大量的RNase,并且RNase不易失活，高温下仍能正确的折叠恢复活性。

如何尽量避免RNase的影响？

● 取样端：

取样过程要取样过程要迅速，所取组织样本离体后，经迅速清洗等处理后，最好立即置于液氮中速冻至少1h以上，之后再转移至-80℃进行保存。液氮速冻能有效抑制样本中内源性Rnase的释放。

● 运输端：

保证运输的低温性，最好加干冰。

● 耗材端：

（1）使用无菌无核酸酶低吸附的枪头、收集管等耗材；

（2）所有使用的剪刀，镊子等需经灭菌消毒后使用，且不能交叉使用。

（3）实验台面需每天使用快速清除Rnase的试剂进行擦拭清洁。

● 实验端：

（1）实验中必须戴口罩，以及勤换手套，长发盘起或绑起，在冰上操作时动作要迅速；

（2）严格执行实验标准操作，试剂使用前进行检查，减少实验中出现的失误；

（3）实验环境污染，人体自然脱落的皮屑或是皮肤携带的细菌霉菌等微生物都可能成为RNA酶的来源从而影响RNA的提取。因此，在实验过程中要养成严谨的无菌操作习惯，防止微生物污染。

▲ 戴手套，无菌操作

如何提高核酸得率？

● 不同样品其RNA含量往往差别很大：高丰度（2~4 μg/mg）的如：肝脏、胰腺、心脏，中丰度（0.05~2 μg/mg）的如：脑、胚胎、肾脏、肺、胸腺、卵巢，低丰度（<0.05 μg/mg）的如：膀胱、骨、脂肪。

● 选择合适的RNA抽提方法：根据样本的组织类型选用合适的抽提方法，当样本比较珍贵时，可以先取少量样本进行提取方法的摸索，确定方法后再进行后续提取。

● 裂解细胞使RNA尽可能完全被释放出来——电动匀浆比其它匀浆方法效果更好，但也需根据具体情况结合其它方法，如液氮捣碎，酶消化等。

● 优化抽提方法：苯酚法的最大问题是分层不彻底导致部分RNA的丢失（不能全部将上清液取出），其原因是核酸和蛋白质含量高，可通过增加裂解液用量或者降低样品量来改善。若样品是脂肪组织，则需增加一步氯仿抽提。如果RNA丢失，可用反抽法或者去除有机层后再离心的方法解决。柱离心法的最大问题是样品过量。

RNA抽提9大细节

1. 尽量避免RNase的影响，快速阻止RNase活性，样品经前处理后快速冷冻裂解时，要快速操作灭活RNase；

2. 选择合适的抽提方法。核酶含量高的组织及脂肪组织最好用苯酚法处理。

3. 预判质量要求。RT-PCR对完整性要求不是很高，但RT-PCR对纯度（酶抑制物残留）要求很高。

4. 彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。

5. 去除DNA。用于RT-PCR时，最好用DNase I去除DNA。

6. 降低外源酶的污染。

7. 低浓度核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂，但要防止助沉淀剂含酶及DNA。

8. 彻底溶解RNA，必要时可以65℃加热5分钟。

9. 根据需求选择合适的保存方法。短时间可-20℃保存，长期请存于-80℃，避免反复冻融。