哈兽研团队最新研究结果显示：2020年美国报道了高致病性的1-4-4 Lineage 1C PRRSV变异株，我国类NADC34 PRRSV属于同一亚型分支（sublineage 1.5），其分子特征是Nsp2基因区域存在相同的100aa连续缺失。由于类NADC34 PRRSV已成为美国主要流行株，因此，类NADC34 PRRSV有可能成为我国PRRSV的潜在流行株，其流行病学及生物学特性需要进一步研究。
摘 要：2020 年美国报道了高致病性的1-4-4 Lineage 1C PRRSV变异株，其对猪的致死率达到17.5%。为了分析美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国当前PRRSV的关系，本研究对中国不同基因亚型的PRRSV与美国新发1-4-4 lineage1C PRRSV变异株进行遗传演化分析。遗传演化分析结果显示，中国类 NADC34 PRRSV与美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株关系紧密，其Nsp2推导氨基酸序列比对结果显示，中国类NADC34 PRRSV与美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株在Nsp2区域存在相同的分子特征，即100 aa（aa328 ~ aa 427）的连续缺失。PRRSV基因重组分析结果显示，美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以类NADC34毒株IA14737-2016为母本毒株，IA/2014/NADC34 和NADC30病毒株提供重组基因片段的重组病毒，而中国早期的类NADC34 PRRSV是以IA/2014/NADC34病毒株为 母本毒株的重组病毒。
美国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪的致病力差异较大，而中国早期的类NADC34 PRRSV对仔猪多为中、低致病力。此外，中国的HLJZD22-1812株与美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株具有类似的重组模式、相同的Nsp2缺失特征、相同的1-4-4 ORF5 RFLP模式，且均属于lineage1C分支。本研究结果首次表明美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国类NADC34 PRRSV属于同 一亚型分支，且具有一致的分子特征，提示类NADC34 PRRSV在我国的流行及演化情况需高度关注。
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2 结果与讨论
2.1 2020年~2021年类NADC34 PRRSV检测结果
对722份猪组织或血清样品，经检测PRRSV阳性为359份，其中类NADC34 PRRSV样品32份，为了进一步探究该类毒株的流行特点及基因组序列变化。本实验选取5份（HLJTZJ829、HLJTZJ864、HLJTZJ921、LNTZJ1341、SDHSW135）样品进行了全基因组序列测定。
本实验室在早期研究中对2020年以前报道的类NADC34 PRRSV毒株进行综合分析，推测其是我国的潜在流行毒株[9]。自2017年本实验室首次报道该类毒株[7] 至2019年底中国共报道了14株类NADC34 PRRSV[9,11,12]，远低于2020年以来的检出数量。尽管本研究检测的样品数量和区域相对有限，但可以看出类NADC34 PRRSV检出数量在PRRSV阳性检出数量中占比有所增加，加大对此类毒株的重视已迫在眉睫。
2.2 Nsp2推导氨基酸序列的分析结果
Nsp2是PRRSV全基因组中变异最大的区域之一，Nsp2区域的基因缺失、 插入或突变常被作为区分不同类型毒株的分子标记。本研究利用MegAlign对中国和美国的类NADC34 PRRSV及美国新发1-4-4 lineage1C变异株的Nsp2推导氨基酸序列进行比对，结果显示，24株类NADC34 PRRSV、RFLP1-4-4 lineage 1C变异株与参考毒株ATCC VR2332相比，均具有100aa（aa328~ aa427）的连续缺失。我国的类NADC34 PRRSV与美国1-4-4 lineage 1C PRRSV变异株具有一致的缺失特征。
2.3 遗传演化分析
本研究对类NADC34 PRRSV和美国新发1-4-4变异株的全基因组、Nsp2和ORF5基因进行遗传进化树的构建。基于全基因组和Nsp2部分基因序列的遗传演化结果显示，美国RFLP 1-4-4 lineage 1C变异株与所有类NADC34 PRRSV均属于Sublineage 1.5亚型，美国RFLP 1-4-4 lineage 1C变异株与所有类NADC34 PRRSV均属于Sublineage 1.5亚型，因此美国新发1-4-4 lineage 1C变异株与类NADC34 PRRSV属于同一亚型。基于ORF5基因遗传演化分析结果显示，我国类NADC34 PRRSV HLJZD22-1812、LNWK96与RFLP 1-4-4 lineage 1C均被划为Sublineage 1.8亚型（NADC30-like），这由病毒基因组序列发生重组导致。
NADC34 PRRSV 及 1-4-4 lineage 1C 变异株分别基于全基因组（A）、 Nsp2（B）、ORF5（C）基因核苷酸序列的系统进化树; 类 NADC34 PRRSV 及美国 1-4-4 lineage1C PRRSV 变异株 Nsp2 推导氨基酸序列比对（D）
Fig. 1 A phylogenetic tree based on the nucleotide sequence of the whole genome (A), ORF5 (B), and Nsp2 (C) genes of NADC34-like PRRSV and 1-4-4 lineage 1C variants. Alignments of NADC34-like PRRSVs and RFLP 1-4-4 lineage 1C variants based on deduced amino acid sequences of Nsp2（D）
2.4 病毒全基因组重组分析结果
近年来，有关PRRSV重组毒株的报道层出不穷，尤其类NADC30毒株进入我国后迅速与我国本土毒株重组，展现出极其复杂的致病性，逐渐成为主要流行毒株[4]。利用RDP4和Simplot生物学软件对我国新发类 NADC34PRRSV(HLJTZJ829、HLJTZJ864、HLJTZJ921、LNTZJ1341、SDHSW135)及美国1-4-4 lineage 1C 变异株的全基因组序列进行对比分析，结果显示，美国1-4-4 lineage 1C 变异株病毒的基因重组区域位于核苷酸1~11681 位(IA14737-2016)、11682~13921位(IA/2014/NADC34)和13922~15058位（NADC30），以上结果表明美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株是以IA14737-2016(NADC34 PRRSV)为母本毒株，IA/2014/NADC34 和NADC30 株提供重组片段的重组病毒。进一步对比分析可见美国1-4-4 lineage1C PRRSV 变异株与中国毒株HLJZD22-1812（MN648450）重组模式非常相近，二者均由类 NADC34毒株提供骨架，并在ORF5 区域与NADC30毒株重组。
与早期报道的类NADC34毒株不同，本团队近期检测到的类NADC34毒株均未发生重组，并且早期报道的类NADC34毒株的重组片段也均由美国毒株提供，类NADC34 PRRSV在我国尚未与本土毒株发生重组。推测类NADC34 PRRSV未与本土毒株重组可能是其在我国致病性整体较弱[8,13]且未爆发性流行的原因之一。
2.5 PRRSV ORF5 RFLP 模式分析
RFLP主要是依据Mlu I、Hind II和Sac II 在ORF5基因上的酶切模式进行划分[14]。RFLP模式分析结果显示，我国NADC34毒株的RFLP模式较为复杂，主要为1-7-4模式（1（MluI= 0）、7（HindII= nt88、219、360）和4（SacII= nt24、555））。其中HLJZD22-1812和美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异毒株均为以类NADC34毒株为骨架NADC30提供重组片段的重组病毒，二者ORF5 RFLP模式均为1-4-4模式（1（MluI=0）、4（HindII= nt88、219）和4（SacII= nt24、555）），基于ORF5的遗传演化分析结果显示HLJZD22-1812也属于lineage1C PRRSV分支。然而RFLP 1-4-4模式和lineage1C仅能展现PRRSV毒株的ORF5基因特征，无法反映PRRSV的全基因组信息，而且RFLP 1-4-4模式的PRRSV 在lineage8、sublineage1.5和sublineage1.8分支中均存在[15]。本研究通过全基因组综合分析发现，1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与中国的类NADC34毒株均具有100aa的连续缺失特征，基于全基因组的遗传演化分析结果表明两者均属于类NADC34 PRRSV。
综上所述，美国1-4-4 lineage1C PRRSV变异株与我国类 NADC34 PRRSV 属于同一亚型分支（sublineage 1.5），其分子特征是Nsp2基因区域存在相同的100aa 连续缺失。由于类NADC34 PRRSV已成为美国主要流行株，因此，类NADC34 PRRSV有可能成为我国PRRSV的潜在流行株，其流行病学及生物学特性需要进一步研究。
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