2019-07-01
本文重点比较分子诊断中竞争较为激烈的恒温扩增技术（LAMP）和实时荧光定量PCR（qPCR）两种技术。
01 检测成本
基于LAMP的仪器更简单更便宜，但LAMP的引物设计难度高，试剂成本会相应高于qPCR。
LAMP只要一个温度（65度左右），加热耗能更少，相对于qPCR的三个温度的循环，基于LAMP的扩增仪器的温控更容易实现。
图一：qPCR技术需要三个温度的循环
02 检测通量
qPCR可以更好的实现高通量检测，对于qPCR而言，由于引物设计的成熟和荧光通道的多样性，往往可以比较好的实现高通量检测。
而LAMP的引物一般需要4-6个（qPCR两个），且LAMP引物一般较长，LAMP的引物设计难于qPCR（虽然有LAMP引物检索网站的协助，但这个问题依然存在），引物设计困难也导致了LAMP的检测通量受限。
图二：LAMP扩增一般需要6个引物
03 检测灵敏度
qPCR的检测灵敏度高于LAMP，意味着，同样的条件下，qPCR检测的假阴性概率低于LAMP
案例一：
Zhibing Lin等人的研究表明使用LAMP和qPCR（real-timePCR）分子诊断技术对于弓形虫DNA的检测极限分别是10fg/ul和1fg/ul[1]。
实验动物
常规PCR/阳性率
qPCR/阳性率
猪/弓形虫
284
0.4%
3.2%
4.2%
羊/弓形虫
292
3.8%
17.1%
17.8%
案例二：
Guangxiang Wang等人的研究表明在羊的口疮病毒检测中，LAMP正确识别出46只阳性中的41只（89.13%）; qPCR (real-time PCR)正确识别出了46只阳性中的42只(91.30%) [2]。
案例三：
Yi Tang等人的研究表明在坦布苏病毒的检测中，qPCR和LAMP的DNA检测极限分别为：2copies/ul和20copies/ul；RNA检测极限分别为10fg/tube和100fg/tube。
检测出来的概率：qPCR和LAMP：82.6%和79.7%[3]。
案例四：
Chapey E.等人的研究表明，在临床弓形虫检测中，有一个病例qPCR检测出来了，LAMP没有检测出来；LAMP检测出来的qPCR均能检测出来；LAMP还有两个病例不确定，qPCR并没有 [4]。
04 扩增特异性
由于LAMP技术一般需要相对较长的6个引物，而qPCR一般2~3个引物，在核酸扩增中只有所有的引物序列都匹配才扩增，理论上基于LAMP的核酸扩增特异性更强。
但扩增的特异性与引物的设计息息相关，并不能简单的比较两个技术的扩增特异性。比如基于两对引物的巢氏PCR的出现，大大的增强了qPCR特异性，这里最典型的应用实例就是filmArray，且LAMP对于扩增500bp以上的DNA比较吃力。
图三：巢氏PCR技术进一步提高了扩增的特异性
05 扩增速度
基于LAPM的扩增速度快于qPCR的扩增速度。
因LAMP扩增不需要反复的升温降温过程，可以短时间内获得大量的DNA产物，而qPCR的扩增速度往往取决于扩增仪器加热和冷却的速率，从这个角度上来看，LAMP更适用于定性的POCT初步确诊，但基于核酸扩增的qPCR能有效缩短诊断的“窗口期”，并且可以定量对病原体进行检测，实现早期诊断。
另一方面，LAMP扩增的快速也导致了终产物的浓度高，交叉污染的概率也大大提高，容易导致假阳性高，且因为没有PCR的温区切换过程而显得比较紊乱，不利于后续的定量。
图四：PCR扩增过程
06 抑制剂敏感性
LAMP对样品中抑制剂敏感性低于qPCR，意味着LAMP对扩增环境的要求低于qPCR。
综上对比，荧光定量PCR与恒温扩增各有优劣，到底该选择哪个？
基于需求出发，LAMP虽然很好的解决了PCR的温控难题，让检测过程更快速简单，但是也相应带来了其他的问题，比如相对于qPCR而言，检测灵敏度不够，引物设计更困难等。从简便性而言，LAMP比荧光定量PCR操作更为方便，但从临床应用而言，荧光定量PCR的检测结果更为可信。
但不管是LAMP还是荧光定量PCR，都还在不断的优化和发展，我们期待着分子诊断技术的成长，为临床诊断带来更好的服务。
参考文献：
1. LinZ, Zhang Y, Zhang H, et al. Comparison of loop-mediated isothermalamplification (LAMP) and real-time PCR method targeting a 529-bp repeat elementfor diagnosis of toxoplasmosis[J]. Veterinary parasitology, 2012, 185(2):296-300.
2. WangG, Shang Y, Wang Y, et al. Comparison of a loop-mediated isothermalamplification for orf virus with quantitative real-time PCR[J]. Virologyjournal, 2013, 10(1): 138.
3. TangY, Yeh Y T, Chen H, et al. Comparison of four molecular assays for the detectionof Tembusu virus[J]. Avian Pathology, 2015, 44(5): 379-385.
4. ChapeyE. et al. An evaluation of a loop-mediated isothermal amplification (LAMP)assay to detected Toxoplasma gondii in clinical specimens.
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